以下實(shí)驗(yàn)方案介紹了貼壁培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞傳代的一般流程。請(qǐng)注意昆蟲細(xì)胞與哺乳動(dòng)物細(xì)胞傳代的一些關(guān)鍵步驟有所不同。更多信息請(qǐng)參閱下一頁(yè)的“昆蟲細(xì)胞傳代的注意事項(xiàng)”部分。
為自己所用的細(xì)胞系傳代時(shí),建議您嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)中所有產(chǎn)品附帶的操作說明。偏離某種細(xì)胞所需的培養(yǎng)條件會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞表型異常,甚至培養(yǎng)*失敗。
所需材料 :裝有貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)容器
:經(jīng)過組織培養(yǎng)處理的培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿
:*生長(zhǎng)培養(yǎng)基,預(yù)熱至37℃
:一次性無菌15-ml試管
:37℃培養(yǎng)箱,充有二氧化碳濃度為5%的濕化空氣
:平衡鹽溶液,例如:杜爾貝科磷酸鹽緩沖液(DPBS),不含鈣、鎂和酚紅
:解離劑,例如:胰蛋白酶或TRYPLE™EXPRESS,不含酚紅
:用于活細(xì)胞和總細(xì)胞計(jì)數(shù)的試劑和設(shè)備,例如:countess™||自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、臺(tái)盼藍(lán)染料或血球計(jì)數(shù)器。
貼壁細(xì)胞傳代流程 所有與細(xì)胞接觸的溶液和設(shè)備均為無菌狀態(tài)。必須采用正確的無菌技術(shù),并且在層流通風(fēng)櫥內(nèi)工作。
- 從培養(yǎng)容器中吸出用過的細(xì)胞培養(yǎng)基并丟棄
- 用不含鈣和鎂的平衡鹽溶液沖洗細(xì)胞(每10cm 2)培養(yǎng)表面面積需要2ml溶液)。從與貼壁細(xì)胞層相對(duì)的容器一側(cè)輕輕加入沖洗液,以避免攪動(dòng)細(xì)胞層,前后搖晃容器數(shù)次。
注:沖洗步驟可去除可能抑制解離劑作用的少量血清、鈣和鎂。
- 從培養(yǎng)器中吸出沖洗液并丟棄。
- 向培養(yǎng)瓶中加入預(yù)熱的解離劑(例如:胰蛋白酶或tryple™);試劑量應(yīng)足以覆蓋細(xì)胞層(每10cm2大約0.5ml)。輕輕搖晃容器,使試劑*覆蓋細(xì)胞層。
- 將培養(yǎng)容器在室溫下孵育約2分鐘。請(qǐng)注意實(shí)際孵育時(shí)間根據(jù)所用細(xì)胞系不同而有所差異。
- 在顯微鏡下觀察細(xì)胞解離情況。如果解離程度未達(dá)90%,可將孵育時(shí)間延長(zhǎng)幾分鐘,每30秒鐘檢查一次解離情況,也可輕輕拍打培養(yǎng)容器以加快細(xì)胞解離。
- 細(xì)胞解離程度大于90%時(shí),傾斜培養(yǎng)容器,使細(xì)胞上液體盡快流盡。加入所用解離劑兩倍體積的預(yù)熱*生長(zhǎng)培養(yǎng)基。吹打細(xì)胞層表面數(shù)次,使培養(yǎng)基分散。
- 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15-ml錐形管中,以200×g的離心力離心5至10分鐘。請(qǐng)注意離心速度和時(shí)間依細(xì)胞種類不同有所差異。
- 用少體積的預(yù)熱*生長(zhǎng)培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞沉淀,取出少量樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)。
- 采用血球計(jì)數(shù)器、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀按照臺(tái)盼藍(lán)拒染法或者使用countess™||自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞百分比。必要時(shí),可再次向細(xì)胞中加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基,以便達(dá)到所需的細(xì)胞溶度,并重新進(jìn)行計(jì)數(shù)。
注:我們建議使用countess™||自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞百分比。Countess™||自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)所需的樣本量與您目前使用的血球計(jì)數(shù)器所需量相同,且不到10秒鐘即可完成一個(gè)樣本的典型細(xì)胞計(jì)數(shù),適用于各種真核細(xì)胞。
11:將細(xì)胞懸液稀釋到該細(xì)胞系推薦的接種密度,并將適量體積的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的細(xì)胞培養(yǎng)容器中,把細(xì)胞放回培養(yǎng)箱。
注:如果使用培養(yǎng)瓶,將其放入培養(yǎng)箱前應(yīng)將瓶蓋旋松,以便進(jìn)行充分的氣體交換,除非您使用的是通風(fēng)式培養(yǎng)瓶和透氣性瓶蓋。
貼壁昆蟲細(xì)胞傳代的注意事項(xiàng)
雖然昆蟲細(xì)胞傳代的一般步驟與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相同,但是這些培養(yǎng)系統(tǒng)的一些關(guān)鍵要求有所不同。為了獲得滿意結(jié)果,實(shí)驗(yàn)中必須嚴(yán)格遵守所有產(chǎn)品附帶的操作說明。
- 昆蟲細(xì)胞應(yīng)在對(duì)數(shù)期傳代。但是,如果培養(yǎng)的是強(qiáng)貼壁性昆蟲細(xì)胞,則應(yīng)在細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)或者剛剛開始從培養(yǎng)瓶底部脫離時(shí)進(jìn)行傳代,因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)胞容易脫離。
- 細(xì)胞密度低于匯合狀態(tài)的20%時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)會(huì)受到抑制。健康狀態(tài)的細(xì)胞是對(duì)數(shù)期收獲的細(xì)胞。
- 培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞時(shí)建議不要二氧化碳交換。
- 昆蟲細(xì)胞應(yīng)于27℃、非濕化環(huán)境中培養(yǎng)。在避光條件下可將細(xì)胞放在操作臺(tái)上或者放入抽屜中于室溫下培養(yǎng)。但是,建議使用溫度控制在27℃的環(huán)境。
- 使用昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)基。
- 在無血清培養(yǎng)條件下,昆蟲細(xì)胞與基質(zhì)貼附極為牢固,需要花費(fèi)較大力氣才能使其脫落。要使細(xì)胞脫落,可以采用拍掌的動(dòng)作快速振搖一下培養(yǎng)瓶。為了避免污染,進(jìn)行此操作前必須蓋緊蓋子。
警告:建議不要?jiǎng)×覔u晃培養(yǎng)瓶,因?yàn)檫@樣可能會(huì)造成細(xì)胞損傷。
PS:如需細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)產(chǎn)品,敬請(qǐng)聯(lián)系我司!