在細胞培養(yǎng)中??梢姷郊毎芭囵B(yǎng)液中有一些大小不等、形態(tài)不同的黑色顆粒在運動。如果鏡下檢查(100x)每視野計數(shù)在 10 個以上者就可能使細胞生長受到影響,如果其數(shù)量再增多細胞可停止增殖繼而死亡。人們常稱這種顆粒為黑膠蟲或中毒顆粒。
Ø 關(guān)于黑膠蟲的描述
ü 分類上的描述
對于黑膠蟲的分類,學(xué)術(shù)界沒有明確給予說法。關(guān)于黑膠蟲的分類,目前大部分人認為黑膠蟲污染是微生物感染。在一些文章論述上把黑膠蟲歸為生物污染類型,但是沒把它歸為確定的生物分類類型,只是把黑膠蟲獨立為一種未知生物。而根據(jù)中國病毒所和軍科院鑒定是一種寄生于牛血清內(nèi)的一種原蟲,似乎和草履蟲和變形蟲有類似之處,但是由于課題經(jīng)費不夠而不能繼續(xù)下去,終也沒有有力證明黑膠蟲是屬于原蟲。也有一些學(xué)者不認為所謂的黑膠蟲污染是一種生物污染,而認為是細胞碎片類物質(zhì),是在細胞培養(yǎng)時,細胞衰亡破裂產(chǎn)生的;也有在文獻中報道說是玻璃瓶中類似氧化硅的物質(zhì),那個文獻很少人找得到;還有報道黒膠蟲是一種納米級的細菌。
ü 形態(tài)上的描述
形態(tài)上類似與桿狀細菌,但長度比細菌長,直徑約在 0.5~1 微米,不染色觀察為黑色;膠蟲成熟后呈線狀,而且形態(tài)是橢圓形。
ü運動形式
在400x 倒置顯微鏡小,有典型的布朗運動(不規(guī)則的原地小距離抖動),即很多細胞培養(yǎng)者看到的,像黑色的小蟲游來游去??梢源┩笧V膜,也可以通過 空氣傳播,低倍下為黑色點狀,高倍下可看見黑色的小蟲游來游去。但是在物理學(xué)上來說,顆粒足夠小,在液體中也是做布朗運動的,這不足以說明黑膠蟲的布朗運動就證明它是生物。
ü 生理上的描述
抗性
抗細菌和抗霉菌的藥物對黑膠蟲均無效,可以保守的判定黑膠蟲不屬于細菌。
環(huán)境抗逆性
將培養(yǎng)器材 150 度烘烤 8 小時,可以消除,這個黑膠蟲高壓滅菌泡酸都不死。可見黑膠蟲可以耐高溫高壓,而且還有點嗜酸,如果證實它是生物的話,那它很有可能是微生物,一種古菌。
營養(yǎng)條件
“黑膠蟲”可寄生于動物細胞,也可以生存于培養(yǎng)基中,依靠細胞和培養(yǎng)基中的營養(yǎng)為生,并隨細胞傳代而傳代??梢?span style="font-size:10.5pt">“黑膠蟲”可能是一種異養(yǎng)生物。
Ø 對黑膠蟲的各種猜測及相應(yīng)的處理
ü 非生物類
細胞碎片類
在細胞培養(yǎng)的時候,由于細胞代謝、物質(zhì)交換、周邊環(huán)境變化,尤其是在從 37 度培養(yǎng)箱中拿出來觀察的過程中,由于液體培養(yǎng)基的比熱較大,液內(nèi)溫度高于外界溫度,造成冷熱交換、小范圍內(nèi)形成液體流動加劇,當(dāng)然這些小歲末就會被攪動起來形成似乎“游動”的感覺;隨著細胞培養(yǎng)的繼續(xù),部分細胞開始衰亡,細胞膜結(jié)構(gòu)破裂,破裂之后的細胞內(nèi)容物泄露到培養(yǎng)液中。尤其是溶酶體的破壞,連續(xù)性地造成其他細胞和細胞器的損傷,如果換液不很勤,又會出現(xiàn)進一步破壞和殘渣的出現(xiàn);再者,“黑膠蟲”問題是很多細胞培養(yǎng)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的問題,但到目前為止尚未找到其監(jiān)測和排除的試劑和手段,這首先是由于所謂“黑膠蟲”病原體根本難以收集和捕捉,這也從另一個側(cè)面證明了“黑膠蟲”問題的難以確定性;再說任何一種外來的微生物在培養(yǎng)基中都會有生命活動的反應(yīng)和表現(xiàn),而不是簡單地運動那樣的外觀性表現(xiàn)。舉一個例子:如果“黑膠蟲”的運動狀況已經(jīng)到了用顯微鏡已經(jīng)可以觀察出的程度,其營養(yǎng)代謝和能量需求也就可想而知。這樣,培養(yǎng)液中的影響消耗、酸堿含量程度等都要發(fā)生明顯變化。比如說:迅速的、大含量的沉淀,pH 值的迅速下降,細胞大量破碎死亡、引發(fā)其它類型微生物侵染等等。而這些狀況,在所謂的“黑膠蟲”感染中,是很難觀察到的。同時“黑膠蟲”的出現(xiàn)而影響細胞狀態(tài)似乎得不到有力的證據(jù)。倒是細胞狀態(tài)下降的時候,“黑膠蟲”明顯增多了。很有可能是細胞狀態(tài)下降時,細胞衰亡產(chǎn)生的細胞碎片。所以黑膠蟲屬于細胞碎片是比較可能和合理的。
玻璃培養(yǎng)瓶中的類似氧化硅的東西
網(wǎng)上有一篇文章說,黑膠蟲其實不是一種生物,是無機物,其本質(zhì)是玻璃培養(yǎng)瓶里的硅顆粒。可影響細胞生長,細胞狀態(tài)好時,不明顯。細胞狀態(tài)較差,數(shù)量少時才容易看到,可用一次性培養(yǎng)瓶,可消除黑膠蟲影響。
血清聚合物產(chǎn)物
Gibco 公司的血清說明,此物為血清聚合產(chǎn)物,而不是微生物。
ü 生物類
支原體
有人曾認為黑膠蟲可能是支原體污染,因為相對比較的網(wǎng)站文章指出,黑膠蟲可以通過濾膜,可以在空氣中傳播。而恰巧口腔支原體為人體口腔中之正常菌叢,所以實驗室之操作人員的污染亦可能為支原體的污染源。但有人為此做了實驗證明黑膠蟲不會是支原體,原因如下:
1、光鏡下可見,因為體積不對,支原體在普通顯微鏡下不能看到。
2、多種染色后可見,甚至 hoechst 即能將它染色,一般來說支原體用普通染色法不易著色,用姬姆薩染色很淺,革蘭染色為陰性。所以,黑膠蟲是一種支原體的可能性比較小。
真菌
有很多人發(fā)現(xiàn)類似黑膠蟲的,但后確定是真菌,二性霉素 B 對其有效。那說明黑膠蟲不存在只是細胞培養(yǎng)中的真菌感染,還是說明黑膠蟲污染屬于真菌類污染物。如果黑膠蟲是一種真菌,那么由此引起的污染是不會引起那么多人的關(guān)注,即使它很特殊。但是這不能排除那些認為“黑膠蟲”是真菌的細胞者,看到的只是一般真菌感染。由于細胞被感染了,要進行拯救處理,不像理論上那么簡單,稍有不注意都是很容易導(dǎo)致培養(yǎng)失敗,所以黑膠蟲是一種真菌也是不太可能。
寄生類原蟲
黑膠蟲屬于寄生類的原蟲,而不是細菌、支原體,也不是什么補體、細胞碎片或蛋白沉淀。有人在 400 倍以上的高倍鏡下可以清楚的看到膠蟲有兩種不同形態(tài),一種較大,運動較慢,泛紅光;另一種較小,運動較快,紅中帶綠,個小的圍著個大的分布,很可能是公的圍著雌的。這種生物也并非離開細胞就不能存活,也有人做過這樣的試驗,單純培養(yǎng)過污染膠蟲的血清 4 周,直到滿視野都是黑煤渣般的膠蟲。給人的感覺是膠蟲和細胞一樣有叢集性,如果膠蟲密度低則生長緩慢,如果手懶,拖了幾天沒換液,待膠蟲生長到一定濃度后便會飛速分生,細胞受感染的程度也大,這時除了培養(yǎng)基中可見外,細胞表面通常也象長滿了粉刺,所以有人認為細胞旁分泌的某些因子可以抑制膠蟲的生長。據(jù)說,中國病毒所和軍科院鑒定是一種寄生于牛血清內(nèi)的一種原蟲,似乎和草履蟲和變形蟲有類似之處,然而由于課題經(jīng)費不夠而不能繼續(xù)進行下去,所以并沒有明確的證據(jù)證明此項猜測的正確性。
Ø解析
從前面關(guān)于黒膠蟲的描述可以看出,人們遇到的黒膠蟲并不都是一樣的,有像細菌的、有像支原體的、有像原蟲的、有像真菌的,還有像細胞碎片的。在國內(nèi)各實驗室的器材條件參差不齊,而且實驗人員的操作質(zhì)量也不盡相同,同一種現(xiàn)象也可能有些許差異,當(dāng)用描述出來的現(xiàn)象的差異可能變大也可能變小。所以很多人看到細胞被細菌污染了,不好處理,而卻描述出來的現(xiàn)象和流傳的黑膠蟲類似,就會把培養(yǎng)失敗的原因歸結(jié)到的黒膠蟲污染,甚至可能說它發(fā)現(xiàn)的是真正的黑膠蟲。這樣的事情多了,黑膠蟲就會人為的變種,像什么的都有。黑膠蟲是否存在,還有待于科學(xué)的發(fā)展。但有一點可以肯定的,大部分人發(fā)現(xiàn)的“黒膠蟲”并不是真正那個未知的黒膠蟲,而是常見的細菌、真菌、原蟲等微生物污染。
Ø關(guān)于黑膠蟲的報道
在《細胞生物學(xué)雜志》有一篇關(guān)于《對細胞培養(yǎng)中一種黑色運動顆粒性質(zhì)的研究》論文,文中經(jīng)過多種實驗驗證后指出:“在組織培養(yǎng)中常觀察到一種大小不等、形態(tài)不同的黑色運動顆粒,它對培養(yǎng)細胞的生長有不良影響,有時甚至導(dǎo)致細胞死亡,并能在一定條件下隨著時間的增長而增加其數(shù)量。人們稱這種顆粒為黑膠蟲或中性顆粒。我們?nèi)〖毎囵B(yǎng)中的血清,培養(yǎng)基和其他材料中的黑色運動顆粒,用光學(xué)顯微鏡,透射電鏡和掃描電鏡對其形態(tài)學(xué)進行系統(tǒng)觀察,并用顯微鏡攝影觀察期活動情況,用紫外分光及電泳透析進行圣生化分析。結(jié)果均證明該顆粒為無膜式結(jié)構(gòu),無蛋白質(zhì)成分,中性環(huán)境下帶正電荷,能譜掃描電鏡分析為硅復(fù)合物,我們稱之為硅小體。鄭證明其活動為布朗運動。