在培養(yǎng)細胞的過程中,你是否遇到:
本應(yīng)貼壁的細胞,某次傳代后出現(xiàn)不貼壁了?
細胞養(yǎng)不起來,生長速度緩慢,或突然停滯生長?
細胞狀態(tài)不好,視野中總是存在較多死細胞?
想要知道如何才能把細胞養(yǎng)好,我們需要先明確培養(yǎng)細胞的3個關(guān)鍵要素:良好的細胞來源,嚴謹?shù)膶嶒灢僮?,正確的培養(yǎng)體系。關(guān)于操作,其中存在許多人為不可控因素,我們后期會另辟專題討論,今天重點聊下如何正確選擇合適的培養(yǎng)體系。
細胞的培養(yǎng)體系一般指用于培養(yǎng)細胞的*培養(yǎng)基,它在培養(yǎng)細胞過程中主要發(fā)揮4大功能:提供營養(yǎng)物質(zhì)、維持細胞穩(wěn)態(tài)、提供物質(zhì)傳遞的介質(zhì)和指示細胞環(huán)境,同時也要保證培養(yǎng)基對所培養(yǎng)的細胞不會造成毒害或污染。通常情況下,細胞*培養(yǎng)基是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、細胞因子和血清所組成。
01 基礎(chǔ)培養(yǎng)基
目前市面上可選擇的基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類很多,如常用的DMEM(高糖/低糖)、培養(yǎng)腫瘤細胞的RPMI 1640等。這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基可滿足大部分細胞培養(yǎng)的需求,但在培養(yǎng)某些較為特殊的細胞如干細胞時,培養(yǎng)的效果經(jīng)常不盡人意,這便需要對培養(yǎng)基的成分進行個性化調(diào)整。
OriCell會通過平行試驗,針對不同的細胞嘗試多種基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分析并增減各培養(yǎng)基的成分,甚至將不同種類培養(yǎng)基按不同比例進行調(diào)和等多種方式,甄選出細胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
02 細胞因子
細胞因子則主要為白細胞介素類、生長因子類、腫瘤壞死因子等,發(fā)揮促進增殖分化、調(diào)節(jié)免疫等作用。
03 胎牛血清
在細胞培養(yǎng)體系中,血清是不屬于人工合成的成分,同時也讓血清成分成為細胞培養(yǎng)體系中大的不確定因素,因此,如何選擇合適的血清是細胞培養(yǎng)得好壞的決定性因素之一。根據(jù)采血時機的不同,牛血清可分為胎牛血清(Fetal Bovine Serum,F(xiàn)BS)、新生牛血清和小牛血清,我們細胞培養(yǎng)中一般使用的是胎牛血清。
胎牛血清是在母牛懷孕3-8個月時,通過胎牛心臟穿刺采血獲得新鮮的胎牛全血,經(jīng)自然層析、離心后收集得到去除血細胞、纖維蛋白等成分的淡黃色透明上清液體,并在生產(chǎn)過程使用多級高置流膜過濾技術(shù)和三級0.1µm終端微濾方法處理而獲取的血清。相比于新生牛和小牛血清,胎牛血清中所含的抗體、補體等對細胞有傷害的成分少,因此對于一些較“脆弱”的細胞如干細胞、原代細胞,一定要使用優(yōu)質(zhì)的胎牛血清進行培養(yǎng)。
04 胎牛血清的功能
血清的成分十分復(fù)雜,既有協(xié)助物質(zhì)運輸?shù)牡鞍?、營養(yǎng)物質(zhì),還有促進細胞生長的激素和因子等,正因為血清這種天然成分的復(fù)雜性,使得血清在細胞培養(yǎng)過程中發(fā)揮了多種功能:
? 提供維持細胞生長的激素,促進所培養(yǎng)細胞的生長;
? 彌補基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或含量很少的營養(yǎng)物質(zhì);
? 提供結(jié)合蛋白,促進細胞識別和利用維生素、脂類和其他激素等;
? 某些情況下結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合,起到解毒作用;
? 促進細胞貼壁,提供可促進細胞鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)的因子;
? 起酸堿度緩沖液作用;
? 提供蛋白酶抑制劑,使細胞消化時殘留的胰蛋白酶失活,保護細胞不受傷害。
05 胎牛血清的使用
在細胞培養(yǎng)過程中,胎牛血清的使用濃度一般在5%-10%,有特殊要求的濃度在20%。
血清對溫度比較敏感,不使用時必須保存在-20℃。解凍血清時要預(yù)防沉淀發(fā)生,不能直接將冷凍的血清放入37℃水浴或者溫箱中,因為血清在融化時,蛋白先融而冰塊后融,局部蛋白濃度過高易發(fā)生沉淀,影響血清質(zhì)量。
若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物,則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾,勿直接過濾血清,一般情況下不過濾也不會對效果造成影響。血清在解凍后,如果一次無法用完一瓶,可按 40~50mL分裝于無菌處理瓶中,再放入-20℃保存,避免反復(fù)凍融。
06 胎牛血清使用不當?shù)娘L(fēng)險
近年來疫情頻發(fā),很多都是動物來源的病毒傳播,我國對于動物源制品的進口一直有很嚴格的規(guī)定,而對于疫區(qū)來源的胎牛血清,同樣存在較大的生物學(xué)污染風(fēng)險,比如病毒、支原體、噬菌體污染等。這對于使用血清進行科研的實驗操作人員造成了重大的潛在隱患,因此,國內(nèi)*對此也有明確的公告:未經(jīng)檢疫的胎牛血清可能攜帶傳染性物質(zhì),一旦流入境內(nèi),將會對人民群眾的生命健康造成重大威脅,如可能帶有瘋牛病病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛細小病毒、狂犬病毒或其他傳染性物質(zhì),具有*的檢疫風(fēng)險。
此外,不合格的血清對實驗的重復(fù)性、穩(wěn)定性和真實性也會造成嚴重影響。
1)無合格質(zhì)檢的胎牛血清存在支原體、病毒等污染,這對涉及細胞培養(yǎng)的實驗結(jié)果會造成不良影響;
2)采血工藝不規(guī)范導(dǎo)致溶血,溶血較嚴重的血清含有許多胞內(nèi)產(chǎn)物,對細胞有刺激作用,影響實驗的穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)的真實性;
3)血清批次不穩(wěn)定,實驗結(jié)果難以重復(fù)。
07 如何選擇合適的胎牛血清
由于胎牛血清來源的特殊性,這使得選擇血清也成為了一門技術(shù)活。那么如何來甄別和選擇血清呢?
受供體飼養(yǎng)環(huán)境、生產(chǎn)工藝等因素的影響,原產(chǎn)澳洲、新西蘭的血清是目前品質(zhì)較高的血清來源。雖然北美洲的血清質(zhì)量也較高,但受疫情及國家進口政策的限制,目前尚無正規(guī)渠道購買北美的血清產(chǎn)品。
1)顏色:根據(jù)血紅蛋白含量的不同,胎牛血清可表現(xiàn)出黃色或紅色,實際上,血紅蛋白含量的高低對血清質(zhì)量并無直接影響,這個指標的意義在于能體現(xiàn)出采血過程的嚴謹規(guī)范程度。胎牛血清或多或少總有點溶血,因為真正的胎牛血清凝血功能差,紅細胞容易破裂。
2)澄清度:高質(zhì)量的胎牛血清由于蛋白和脂類等物質(zhì)含量低,表現(xiàn)為稀薄、清淡,而新生牛血清,相對而言更加粘稠,顏色略深。
3)血清沉淀:血清有沉淀,是質(zhì)量問題?血清中的沉淀是由纖維蛋白的凝聚產(chǎn)生,對血清質(zhì)量沒有任何影響,沉淀的產(chǎn)生原因很多,跟加工生產(chǎn)方式、是否反復(fù)凍融密切相關(guān)。雖然沉淀并不直接影響血清的質(zhì)量,但對細胞的顯微觀察有一定的阻礙。
采購血清要關(guān)注血清的批間差異。經(jīng)驗豐富的供應(yīng)商會制定嚴謹?shù)馁|(zhì)檢標準,確保血清篩選標準的一致性,盡可能降低血清的批間差異,盡可能消除因采血、生產(chǎn)、貯藏工藝不同而造成的批間差異。
后,適合自己細胞生長的才是hao的。
08 胎牛血清有哪些重要的技術(shù)性指標?
1)內(nèi)毒素:標準為不高于10EU/mL。內(nèi)毒素是細菌破碎后細胞壁的成分,因此內(nèi)毒素含量的高低可表現(xiàn)出采血到生產(chǎn)一系列過程中的無菌操作情況。
2)總蛋白含量:胎牛血清總蛋白含量一般范圍是30-50mg/mL,數(shù)值偏高,說明采血的牛齡偏大,不是胎牛,數(shù)值偏低,表明血清可能摻水了。
3)血紅蛋白:標準為不高于30mg/dl,顏色越紅,數(shù)值越高。
4)pH:7.0~8.0。
5)微生物:包括細菌、霉菌、支原體、噬菌體、各類病原性病毒等。
6)免疫球蛋白(IgG):免疫球蛋白的數(shù)值能*體現(xiàn)出采血時的牛齡情況,新生牛的血清中容易產(chǎn)生IgM,IgG的含量也偏高,進口胎牛血清不含IgM,另外IgG的含量也較低。