干細(xì)胞 作為一種能夠自我更新和分化的細(xì)胞類型,已經(jīng)為世人熟知。自被發(fā)現(xiàn)起,干細(xì)胞就一直是研究熱點。根據(jù)《 2016-2022 年中國干細(xì)胞醫(yī)療行業(yè)市場現(xiàn)狀與行業(yè)前景調(diào)研分析報告》,2010 年干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)市場規(guī)模為 215 億美元,到 2015 年時已增至 635 億美元。預(yù)測到 2020 年,干細(xì)胞市場規(guī)模達(dá)到 4000 億美元。
作為在再生醫(yī)學(xué)中使用的干細(xì)胞類型,間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)有著巨大的市場價值空間且不斷被看好。
如今,MSC 是臨床試驗中干細(xì)胞類型,也是科學(xué)文獻(xiàn)中研究多的干細(xì)胞類型。
范圍內(nèi)其相關(guān)的臨床試驗超過 900 項,中國臨床試驗注冊中心注冊的 MSC 臨床試驗超過 104 項。這充分說明 MSC 治療是世界范圍內(nèi)臨床應(yīng)用研究的熱點,而我國在這一領(lǐng)域的發(fā)展也勢頭強勁。
MSC 幾乎存在于我們體內(nèi)的所有組織中,但常見于骨髓、脂肪組織、臍帶組織、臍帶血和胎盤。除了具有多功能性和分化成多種細(xì)胞譜系外,它們還能分泌多種細(xì)胞因子和生長因子,從而實現(xiàn)免疫調(diào)節(jié),促進損傷愈合和組織再生。
MSC 非常適合細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用,因為它們具有多種譜系分化潛力。
它們可以在體外或體內(nèi)分化成不同類型的功能細(xì)胞以代替老化或受損細(xì)胞。因為 MSC 的這些特性,其在 2020 年的治療中也表現(xiàn)出了積極效果,病毒感染誘發(fā)機體內(nèi)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),炎性細(xì)胞因子增加、外周淋巴細(xì)胞減少、肺部損傷等,MSC 具有免疫調(diào)節(jié)能力和損傷修復(fù)功能,所以具有治療的潛能。目前的初步臨床結(jié)果顯示間充質(zhì)干細(xì)胞移植具有安全性和初步的有效性,能夠為重癥患者提供新的治療工具。
當(dāng)前,干細(xì)胞療法處在技術(shù)到產(chǎn)品轉(zhuǎn)化的過度階段。那么如何在體外進行細(xì)胞規(guī)?;母咝U增,是 MSC 應(yīng)用中的關(guān)鍵。
傳統(tǒng)擴增 MSC 的主要方式是采用方瓶、細(xì)胞工廠等進行 2D 貼壁培養(yǎng),一個病人單次需要回輸幾個億單位的細(xì)胞,那么就需要大量的 2D 培養(yǎng)容器以及操作人員;對于貼壁類型的細(xì)胞培養(yǎng),如果想要規(guī)?;a(chǎn),微載體是不錯的選擇方式,新型的擴增 MSC 的方式是使用微載體以及波浪式反應(yīng)器 WAVE,可以高效的進行干細(xì)胞的擴增,培養(yǎng)過程如下:
一、實驗材料
細(xì)胞:間充質(zhì)干細(xì)胞
培養(yǎng)方式:微載體 Cytodex 1 貼壁培養(yǎng)
培養(yǎng)基:無血清無外源蛋白成份明確間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(由原能細(xì)胞科技集團自主開發(fā))
反應(yīng)器:WAVE 25
二、實驗步驟
1.
微載體的預(yù)處理
1.1 微載體處理:Cytodex 1 使用 DPBS 泡發(fā) 3 h。
1.2 使用 DPBS 洗滌 2 次 Cytodex 1,DPBS 浸泡后滅菌(121℃,30 min)。
1.3 Cytodex 1 冷卻沉淀后,棄上清,安全柜內(nèi)無血清培養(yǎng)基洗滌 2 次,定容。
2.
WAVE 的操作
2.1 無菌環(huán)境下拆開細(xì)胞袋,安裝無菌空氣濾器等配件。
2.2 將微載體培養(yǎng)液及細(xì)胞懸浮液依次從細(xì)胞袋輸液管道輸入。
2.3 將細(xì)胞袋固定在 WAVE 反應(yīng)器托盤上,連接空氣泵,設(shè)定溫度 37 ± 0.5 度、泵壓、反應(yīng)器轉(zhuǎn)速度和角度。
3.
MSC 細(xì)胞接種及培養(yǎng)過程
3.1 按 6000 cells/cm2接種新鮮 MSC 細(xì)胞至微載體培養(yǎng)液中(3 g/L)),孵育 30 min-1 h(間歇式搖勻)或者孵育過夜,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至細(xì)胞不沉降聚集即可。
3.2 每隔一天從細(xì)胞袋無菌取樣口用無菌注射器抽取 5 ml-10 ml 培養(yǎng)液進行鏡檢及支原體、內(nèi)毒素等安全性質(zhì)量檢測。
3.3 培養(yǎng) 4-5 天,細(xì)胞長滿。
4.
MSC細(xì)胞的收獲
4.1 培養(yǎng) 4-5 天后將細(xì)胞微載體懸浮液從細(xì)胞袋出液管道輸出至細(xì)胞收集瓶。
4.2 棄上清,DPBS 洗滌一遍,加入 Tryple 消化酶,溫和搖勻消化 10 min-15 min。靜置,待微載體沉降后,吸取細(xì)胞懸浮液。DPBS 再洗滌 2 遍,吸取細(xì)胞懸浮液。
4.3 離心 400×g,5 min。收集細(xì)胞,計數(shù)。
三、實驗結(jié)果
1.
細(xì)胞生長情況
按0.6 × 104 cells/cm2接種新鮮MSC細(xì)胞至微載體培養(yǎng)液中(3g/L),4-5天后細(xì)胞可以長滿Cytodex 1,每cm2可以生長2.5 × 104 MSC,細(xì)胞在Cytodex 1上的生長照片如下圖1。
圖 1. 微載體培養(yǎng) MSC 生長圖片
2.
流式細(xì)胞儀檢測MSC細(xì)胞表面標(biāo)記物
藥典對 MSC 細(xì)胞表面標(biāo)記物的檢測要求是:CD73、CD90、CD105 ≥ 95%;CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR ≤ 2%。對上述培養(yǎng)的細(xì)胞進行檢測,結(jié)果顯示細(xì)胞表面標(biāo)記物均滿足要求并且陽性指標(biāo) CD73、CD90、CD105 、CD44 ≥ 98%,陰性指標(biāo) CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR 總和≤ 2%(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖2. 微載體培養(yǎng)MSC流式表型
3.
MSC 成脂和成骨分化
對 MSC 進行成脂和成骨誘導(dǎo)分化,油紅 O 染色后顯示成脂效果很好;茜素紅 S 染色顯示成骨效果很好。
圖3. 微載體培養(yǎng)MSC成脂分化
圖4. 微載體培養(yǎng)MSC成骨分化
四、成本分析
以培養(yǎng)單人次回輸細(xì)胞量 3.2×109 cells 為例,對比新型和傳統(tǒng)擴增 MSC 方式的成本分析,主要從培養(yǎng)階段的耗材成本和人員成本角度考慮,其中耗材成本如下圖 5,使用 Cytodex 1 和 WAVE 的培養(yǎng)方式相較于 150 mm Dish 能夠節(jié)約 14%,相較于 Hyper Flask 能夠節(jié)約 190% 的耗材成本。人員成本角度列于表 1,使用 Cytodex 1 和 WAVE 的培養(yǎng)方式可以減少培養(yǎng)批次,從而降低批次間變異性,同時擁有合理的人員成本。
圖5.不同培養(yǎng)方式耗材成本分析
表1.不同培養(yǎng)方式人員成本分析及批次數(shù)