如何選擇合適的抗體？

科研工作離不開抗體，WB、IP、IHC、IF、ChIP和FC都需要用到抗體，那么這幾種實驗方法中的抗體有什么區(qū)別呢？實驗做不出來，您的抗體選對了么？

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一、關(guān)于特異性的選擇

特異性的選擇主要需要考慮四個方面：蛋白特異性、種屬特異性、實驗方法特異性、標(biāo)記物的特異性。

1、蛋白特異性

針對需要檢測的蛋白查找抗體，幾個細節(jié)要區(qū)分：

a.重組蛋白如果不是全長表達，則需要注意抗體的免疫原區(qū)域是否在重組蛋白區(qū)域內(nèi)。

b.內(nèi)源性蛋白最好能清楚其剪切與修飾的方式，特殊表型的蛋白需要進行序列比對，并結(jié)合抗體免疫原序列，查看交叉反應(yīng)的情況。

c.磷酸化蛋白檢測需要確定具體位點，不同位點的磷酸化意味著可能有不同的機制存在，不宜一概而論。

2、種屬特異性

同種蛋白不同物種，有著或大或小的差異。

a.目前大部分商品化抗體都是以人源蛋白序列為模板重組蛋白或設(shè)計多肽抗原的，根據(jù)蛋白的同源性的情況與其他種屬發(fā)生交叉反應(yīng)。需要參照說明書注明的可反應(yīng)種屬信息。

b.一些稀有種屬很難找到抗體，可以通過蛋白的序列比對，選擇同源序列免疫的抗體，不過一般這種情況生產(chǎn)商不會受理其關(guān)于質(zhì)量的申訴，如果可以申請到免費的抗體樣品，則利于抗體選擇。

3、實驗方法特異性

目前使用抗體的實驗方法有很多，不同的使用方法過程中，因為對蛋白樣品的處理方式不一樣，蛋白的含量有差異，對抗體的識別表位和效價要求都是不一樣的。

4、標(biāo)記物的特異性

一般基于實驗操作的實驗方法不會使用帶有標(biāo)記的一抗，比如 WB、IHC 等，都是通過二抗類的試劑標(biāo)記達到結(jié)果呈現(xiàn)的目的。但是基于儀器分析的一些實驗，可能就會使用到直接標(biāo)記的一抗，比如流式實驗。那么需要了解到自己將要使用的儀器能檢測到的熒光范圍，針對不通的參數(shù)要求選擇對應(yīng)的標(biāo)記物。在免疫熒光雙標(biāo)實驗中，需要選配不同的熒光標(biāo)記物。

二、不同實驗對抗體有什么不同的要求？

在理解上面技術(shù)對抗體需求的區(qū)別之前我們首先要知道這些實驗技術(shù)都需要什么樣的抗體。

1、WB

WB的蛋白經(jīng)過加熱變性之后都變成線性的結(jié)構(gòu)。因此zuihaode抗體是采用非常特異序列的人工合成多肽的方法來做實驗，結(jié)果也非常特異。

2、IP/CHIP

我們用抗體去結(jié)合生理狀態(tài)下的蛋白質(zhì)，因此IP的抗體最好使用純化的天然蛋白制作的抗體來做，也可以用純化的重組蛋白的抗體。最好不要用人工合成多肽制作的抗體，因為這種抗體識別的位點可能被深深地藏在了蛋白的內(nèi)心深處。CHIP和IP沒有太大的區(qū)別，weiyi的問題在于，如果抗體識別的表位和該蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合的部位一致，則會導(dǎo)致CHIP實驗的失敗。

3、 IF/IHC

免疫熒光和免疫組化中需要進行固定一步，固定是為了盡量讓細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)維持和原有的一致。這種化學(xué)物質(zhì)的固定使蛋白質(zhì)變性凝固，與天然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)有了一定的區(qū)別，但是又不同WB中加熱變性變成了線性的結(jié)構(gòu)。因此在做IF/IHC實驗中，最合適的抗體可以是純化的重組蛋白得到的抗體，也可以是人工合成多肽得到的抗體（多肽是在蛋白質(zhì)的表面）

4、FC

流式細胞中分為兩種，一種是活細胞的流式，這種流失最好采用是天然蛋白或者重組蛋白的抗體來做，另外一種是經(jīng)過固定之后的流式，和IF/IHC 所用抗體一致。在做流式細胞中，我們有直接標(biāo)記和間接標(biāo)記，間接標(biāo)記不如直接標(biāo)記真實準(zhǔn)確。因此我們選擇流式抗體要采用帶有熒光標(biāo)記的抗體；如果研究的蛋白沒有直接標(biāo)記的抗體，那么就采用間接標(biāo)記抗體，需要添加熒光二抗。

三、怎樣選擇適合你實驗需要的抗體？

1. 一抗選擇要點：

a.確定抗體的名字。注意中英文名字、它名、亞型等信息。

b.確定你的實驗類型。Elisa，WB，IHC，ICC，還是FACS。一般抗體的說明書都會列出該抗體經(jīng)驗證過適用于何種實驗的類型，如果抗體說明書沒有提及的應(yīng)用類型，并不意味著該抗體不適用于此種分析應(yīng)用類型，而僅是說明尚未經(jīng)過此種實驗驗證，請根據(jù)說明書列出的已驗證的類型來選擇適合你實驗的抗體。

c.確定實驗樣本的種屬。Human，Mouse，還是Rat。一般抗體說明書都列出該抗體經(jīng)試驗驗證過適用于何種物種實驗，請根據(jù)說明書列出已驗證的種屬來選擇適合你實驗的抗體。

d.樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于選擇最合適的抗體，待測樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域和樣本在提取和處理過程中是否會變性，蛋白空間構(gòu)象的改變，會影響抗體的免疫親和反應(yīng)。

e.單多克隆抗體的選擇。市面上的抗體還是以多克隆抗體為主，一般單克隆抗體特異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過封閉等避免）。

2. 二抗選擇要點：

a.種屬來源。主要根據(jù)一抗種屬來源來決定購買二抗來源，如一抗是小鼠來源，那二抗就買抗小鼠的即可（羊、兔等均可）。

b.標(biāo)記物的選擇。有HRP、Biotin、熒光素等標(biāo)記物。一般SP三步法二抗選擇Biotin標(biāo)記的二抗，以與后面的SP結(jié)合反應(yīng)，而免疫熒光染色就需要購買不同熒光素標(biāo)記的二抗。

四、常見的問題

Q1. 做流式的抗體和免疫組化的抗體是一樣的嗎？

不一定能通用。流式是用直接標(biāo)記還是間接標(biāo)記？如果是直接標(biāo)記的話，那這個抗體一般不是FITC標(biāo)記或者就是TRITC，PE之類的。如果恰好你的免疫組化，也是想用熒光素標(biāo)記的抗體來直接標(biāo)記，那就可以通用。如果你的免疫組化要用其它的標(biāo)記的話，或者是間接標(biāo)記的話，就有麻煩，因為熒光素的標(biāo)記很可能會影響二抗和一抗的結(jié)合。

Q2. 為什么我的抗體做WB非常好，而做不了IF，IHC等其他任何實驗？

首先恭喜你有一個WB非常好的抗體，畢竟能獲得做WB非常好的抗體也不容易。其次，你這個抗體很可能是通過人工合成多肽得到的，和上面所述，你用來做抗原的多肽恰好被包埋在蛋白質(zhì)的中心，因此只能識別WB中線性的部分。

Q3. 如何選擇免疫組化抗體？

首先，一抗是選擇單克隆抗體還是多克隆抗體，單克隆抗體特異性強，靈敏度低；多克隆抗體靈敏度高，特異性弱。根據(jù)你的實驗結(jié)果，如果非特異多，那么選擇單克隆抗體；如果陽性信號弱，不妨選擇多克隆抗體試試。一般家兔來源的都是多克隆，小鼠來源的是單克隆。其次是要弄明白該一抗能夠識別什么種屬的抗原，抗體說明書上面一般注明有，比如小鼠Mus, 大鼠Rat, 人Hum。再次比較重要的是要注意一抗的來源。比如我們在人的癌組織中做p53的免疫組化，一抗我們采用的是小鼠來源的p53抗體，那么二抗我們一定要選擇抗小鼠的二抗比如（山羊抗小鼠，兔抗小鼠），這一點非常重要。最后，一般的抗體說明書都會注明能做什么實驗，如果標(biāo)明了不可以做免疫組化，一定不要選擇；反過來說，即使標(biāo)明了可以做免疫組化，也不一定能夠做，商家只會夸大其效果。

Q4. WB和IF的二抗是一樣的嗎？

很明顯，不是！免疫熒光抗體是用于 免疫熒光試驗的，是用FITC或PE等標(biāo)記的抗體，結(jié)果需要紫外線激發(fā)并用熒光顯微鏡觀察WB抗體一般是HRP或堿性磷酸酶等標(biāo)記的抗體，需顯色底物（如OPDTMB等）直接顯色（肉眼）或化學(xué)發(fā)光法顯影（需特殊儀器）。

Q5. 做CHIP的抗體是否可以用來做WB抗體？

不一定，一般來說做CHIP級別的抗體對抗體純度特異性方面都要求比較高，基本上能做CHIP的抗體都可以做WB。但是如果CHIP的抗體識別的是構(gòu)象表位（比如是由兩個實際靠在一起但變?yōu)榫€性結(jié)構(gòu)之后相隔很遠的兩端序列），而不是線性表位，這種CHIP抗體做不了WB。

Q6. 抗體說明書上面沒有寫該抗體能夠用于某項實驗怎么辦？

一般而言，抗體研發(fā)出來之后都要經(jīng)過WB，IP，IF，IHC實驗。檔發(fā)現(xiàn)濃度不夠做IF，IHC時候，國外的抗體一般都是寫未檢測，國內(nèi)的抗體一般是不寫。所以盡量不要抱著試試的心里去嘗試，往往只會浪費時間。你想啊，如果抗體能夠做該實驗，他們肯定會寫上去啊。

Q7. 做ELISA的抗體能否用來做WB？

通常用WB抗體稀釋濃度為1:1000，IF/IHC為1:100，而如果可以做ELISA則可以稀釋1:10000。如果一個抗體用來做ELISA的，那么言外之意就是該抗體效價不高。但不是說ELISA的抗體不能用于做WB，抗體說明書提示做ELISA稀釋比例為1:1000，那么你可以試試1:100做做WB

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