FHC人正常結(jié)直腸粘膜細胞
【細胞縮寫】 FHC細胞
【細胞名稱】 FHC(人正常結(jié)直腸粘膜細胞)
【背景資料】 見細胞說明書
【細胞消化時注意把握消化時間,消化不夠會導致吹打細胞時造成損傷,一般消化時間是2-3分鐘,但以鏡檢時大部分細胞縮回球形為準,一般2次即可將細胞吹打下來,消化不夠進行細胞吹打易損傷細胞。細胞系的凍存液配方:90%FBS+10%DMSO,貼壁細胞若出現(xiàn)分布不均,成島狀生長,可將細胞進行消化,重懸打散細胞,加入新鮮培養(yǎng)基進行培養(yǎng)】 細胞主要來源ATCC、DSMZ、ECACC、RIKEN、promocell、ScienCell、ECACC、JCRB、KCLB、Asterand、ICLC以及少數(shù)國內(nèi)外著名大學建系
【代次】 P4
【規(guī)格】 復蘇T25培養(yǎng)瓶(一瓶)或凍存1ml凍存管(兩支)
【細胞數(shù)】 1*10(6)
【生物安全級別】 1
【生物體】 人
【組織來源】 結(jié)直腸
【細胞形態(tài)】 上皮細胞
【細胞特性】 貼壁
【特別注意:如使用公共實驗室或者初次接觸細胞培養(yǎng),建議添加雙抗培養(yǎng),貼壁細胞收到當天切忌立刻消化,請將細胞換液后放置培養(yǎng)箱孵育到第二天再做消化傳代,請優(yōu)先選擇直徑6cm的培養(yǎng)皿進行傳代培養(yǎng),如果細胞為貼壁細胞,而收到時呈懸浮或者部分懸浮的狀態(tài),請將懸浮的細胞即時離心,細胞加15%血清的*培養(yǎng)基到新的培養(yǎng)皿/瓶繼續(xù)培養(yǎng)3天;同時原培養(yǎng)瓶中剩下的貼壁細胞更換為15%血清的*培養(yǎng)基培養(yǎng)3天。3天后若原瓶或者新瓶中的細胞都沒有出現(xiàn)增值而是繼續(xù)脫落死亡,請及時聯(lián)系實驗室技術(shù)人員會跟進解決】 95%(Viability by Trypan Blue Exclusion)
細胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌
【培養(yǎng)條件】 詳見細胞說明書
【傳代方法】 建議1:2-1:3 兩天換液一次
【凍存條件】 詳見細胞說明書
【主要文獻】 請具體查閱相關(guān)發(fā)表文章
FHC人正常結(jié)直腸粘膜細胞
操作步驟:
1)復蘇細胞:將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍,加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘,棄去上清液,補 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜(或?qū)?細胞懸液加入 10cm 皿中,加入約 8ml 培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜)。第二天換液并 檢查細胞密度。
2)細胞傳代:如果細胞密度達 80%-90%,即可進行傳代培養(yǎng)。
1. 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次。
2. 加 1ml 消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘,然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,若細胞大部分 變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。
3. 按 6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基,輕輕打勻后吸出,在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘,棄去上清液,補加1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。
4. 將細胞懸液按 1:2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3)細胞凍存:待細胞生長狀態(tài)良好時,可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為類;
1. 細胞凍存時,棄去培養(yǎng)基后,PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶,細胞變圓 脫 落后,加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化,可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 血清重懸細胞,根據(jù)細胞數(shù)量加 入血 清和 DMSO,輕輕混勻,DMSO 終濃度為 10%,細胞密度不低于1x106/ml,每支凍存管凍存 1ml 細胞懸液,注意凍 存管做好標識。
3. 將凍存管置于程序降溫盒中,放入-80 度冰箱,2 個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
注意事項:
1.動作要快,胰酶消化,換液什么,細胞暴露在空氣中的時間越少越好。另外,要掌握好胰酶消化時間,所謂的細胞狀態(tài)差,很多時候是傳代的原因。
3.有時間的話,需要細胞計數(shù),傳相應數(shù)目的細胞到培養(yǎng)皿中,可以大致清楚細胞的生長曲線,不會臨時要處理,手足無措。
3.要做什么心里要非常清楚,合理安排時間,細胞房的實驗穿插進行,可以節(jié)省很多時間,也不會耽誤別人的實驗。
4.個人的實驗器具自己收一套,不要和別人混用,zui近換了什么新的東西稍微記一下,試劑一旦懷疑污染,馬上丟。
5.細胞房不能進去太多人,避免相互干擾。