隨著實驗室細胞培養(yǎng)的發(fā)展,除了原代培養(yǎng)之外,人工開發(fā)出來的細胞系的保存越來越重要。冷凍保存細胞系的優(yōu)點如下:1、減少基因漂移;2、減緩細胞系的衰老;3、穩(wěn)定表型;4、減少微生物污染及交叉污染機會等。細胞冷凍的原理在于盡可能降低細胞內(nèi)的晶體形成,減少細胞內(nèi)水凝固所形成的高濃度溶質(zhì)對細胞造成的低溫損傷,從提高細胞復(fù)蘇時的存活率。細胞凍存的數(shù)量應(yīng)保證復(fù)蘇時低溫保護劑獲稀釋,稀釋后的細胞濃度扔高于正常傳代的細胞濃度為宜,這是因為當?shù)蜏乇Wo劑稀釋以后,該濃度一般不會對細胞造成毒性損傷。
Leagene 通用細胞凍存液主要由FBS、DMSO等組成,是非常經(jīng)典的一種無菌凍存液。用于各種哺乳動物原代細胞、傳代細胞系、雜交瘤細胞等的凍存。
自備材料:
1、 細胞計數(shù)器 2、 細胞凍存管 3、 超低溫冰箱或液氮 4、 超凈工作臺
操作步驟:
1、培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長晚起,顯微鏡觀察其外觀、形態(tài)、有無污染等,取狀態(tài)良好的細胞進行凍存操作。如為貼壁生長細胞,用胰蛋白酶消化并用*培養(yǎng)基終止消化,進行細胞計數(shù);如為懸浮生長細胞,進行細胞計數(shù)。
2、離心,棄上清
3、加入適量的通用細胞凍存液,重懸細胞,使細胞濃度達到、ml,置于凍存管中,密封,不要擰的太緊,避免彎曲變形。
4、一般進行凍存。亦可采用-20℃30min,-70℃過夜,后置于液氮罐中長期存儲。
注意事項:
1、注意在超凈工作臺內(nèi)無菌操作,盡量避免污染。
2、初次使用融化后可在4℃保存1個月,單應(yīng)減少反復(fù)凍融的次數(shù),以免失效。
3、雜交瘤細胞凍存時應(yīng)定期復(fù)蘇,檢查細胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性。
4、為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作