GC-1 spg小鼠精原細(xì)胞系
細(xì)胞英文(簡稱):GC-1 spg
細(xì)胞來源: ATCC DSMZ JCM ECACC
代次:P3
規(guī)格:T25
細(xì)胞數(shù):1x10^6 cells
組織來源:精原
細(xì)胞形態(tài):貼壁
細(xì)胞活力:95%(Viability by Trypan Blue Exclusion)
細(xì)胞檢測:細(xì)胞不含有:HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌
培養(yǎng)條件:RPMI-1640 +10% FBS;37℃,5% CO2
傳代方法:建議1:2-1:3 兩天換液一次?
凍存條件:*培養(yǎng)基50%+40%FBS+10%DMSO
傳代細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟
1、 37度水浴加熱所有試劑。
2、 吸取培養(yǎng)培養(yǎng)皿內(nèi)舊培養(yǎng)液,放置一個干凈離心管內(nèi)。(為稍后終止消化作準(zhǔn)備。)
3、 用PBS清洗培養(yǎng)皿,棄去。
4、 向瓶內(nèi)加入消化液(胰蛋白酶液)。以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。(一般一個大皿1ml)
5、 2-5分鐘后,輕輕震蕩培養(yǎng)皿。使細(xì)胞系從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。顯微鏡下觀察若細(xì)胞由貼壁變?yōu)閼腋【图尤胙澹丛囵B(yǎng)液)終止消化。
6、 收集細(xì)胞懸液,880轉(zhuǎn)/分、5分鐘離心,棄去上清液。
7、 加培養(yǎng)液至1ml,混勻后取10ul計數(shù)細(xì)胞。
8、 根據(jù)實驗要求取適量細(xì)胞留種或接種于新的培養(yǎng)皿或96孔板、24孔板中,再加入相應(yīng)體積的培養(yǎng)液。(90mm大皿是9ml,中皿好像是4mm,6孔板和小皿是2ml,96孔板是100ul)。
9、 接種好的培養(yǎng)皿順時針和逆時針各轉(zhuǎn)三圈,使細(xì)胞排列均勻。
10、 放入暖箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
GC-1 spg小鼠精原細(xì)胞系
操作步驟:
1)復(fù)蘇細(xì)胞:將含有 1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍,加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘,棄去上清液,補(bǔ) 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜(或?qū)?細(xì)胞懸液加入 10cm 皿中,加入約 8ml 培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜)。第二天換液并 檢查細(xì)胞密度。
2)細(xì)胞傳代:如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1. 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細(xì)胞 1-2 次。
2. 加 1ml 消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘,然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分 變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。
3. 按 6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基,輕輕打勻后吸出,在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。
4. 將細(xì)胞懸液按 1:2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3)細(xì)胞凍存:待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時,可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為類;
1. 細(xì)胞凍存時,棄去培養(yǎng)基后,PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶,細(xì)胞變圓 脫 落后,加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化,可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 血清重懸細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加 入血 清和 DMSO,輕輕混勻,DMSO 終濃度為 10%,細(xì)胞密度不低于1x106/ml,每支凍存管凍存 1ml 細(xì)胞懸液,注意凍 存管做好標(biāo)識。
3. 將凍存管置于程序降溫盒中,放入-80 度冰箱,2 個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
注意事項:
1.動作要快,胰酶消化,換液什么,細(xì)胞暴露在空氣中的時間越少越好。另外,要掌握好胰酶消化時間,所謂的細(xì)胞狀態(tài)差,很多時候是傳代的原因。
3.有時間的話,需要細(xì)胞計數(shù),傳相應(yīng)數(shù)目的細(xì)胞到培養(yǎng)皿中,可以大致清楚細(xì)胞的生長曲線,不會臨時要處理,手足無措。
3.要做什么心里要非常清楚,合理安排時間,細(xì)胞房的實驗穿插進(jìn)行,可以節(jié)省很多時間,也不會耽誤別人的實驗。
4.個人的實驗器具自己收一套,不要和別人混用,zui近換了什么新的東西稍微記一下,試劑一旦懷疑污染,馬上丟。
5.細(xì)胞房不能進(jìn)去太多人,避免相互干擾。